Mit Streptavidin beschichtete Polystyrolpartikel

Dieser Beitrag stellt eine neuartige Anwendung magnetischer Partikel für die Biosensorik vor, die als Label-Acquired Magnetorotation (LAM) bezeichnet wird. Diese Methode basiert auf einer Kombination des traditionellen Sandwich-Assay-Formats mit der asynchronen Magnetic-Bead-Rotation (AMBR)-Methode. Bei der Markierungs-erworbenen Magnetorotation erleichtert ein Analyt die Bindung eines magnetischen Markierungskügelchens an eine nichtmagnetische Festphasenkugel, wodurch ein Sandwich-Komplex gebildet wird. Der Sandwich-Komplex wird dann in ein rotierendes Magnetfeld gebracht, wobei die Rotationsfrequenz des Sandwich-Komplexes eine Funktion der an der Oberfläche der Kugel anhaftenden Analytmenge ist. Hier verwenden wir Streptavidin-beschichtete Kügelchen und Biotin-beschichtete Partikel als Analytmimetika, die in zukünftigen Arbeiten durch Proteine ​​und andere biologische Ziele ersetzt werden sollen. Wir zeigen, dass dieses Erfassungsverfahren einen dynamischen Bereich von zwei Größenordnungen hat.

Einleitung

Magnetische Mikroperlen wurden in einer Vielzahl von Verfahren als Markierungen verwendet, um das Vorhandensein eines biologischen Moleküls anzuzeigen . Die Grundstruktur dieser Assays beinhaltet das Einfangen des Ziels von Interesse, entweder ein Antigen oder ein Antikörper, auf einer Oberfläche und die Verwendung von Antikörper-markierten magnetischen Kügelchen oder Partikeln, um an das Ziel zu binden. 

• Das Vorhandensein der magnetischen Markierungen kann auf verschiedene Weise gemessen werden, einschließlich Änderungen des Magnetowiderstands , der Relaxationszeit , der Translationsbewegung  und der Partikelagglutination  In diesem Artikel demonstrieren wir die Label-erworbene Magnetorotation, bei der das Ziel die Bindung von magnetischen Label-Beads an eine nichtmagnetische Kugel erleichtert und die Rotationsfrequenz des resultierenden Sandwich-Komplexes in einem rotierenden Magnetfeld von der Anzahl der angebrachten magnetischen Label-Beads abhängt .
• Die etikettenerworbene Magnetorotation basiert auf den Prinzipien der asynchronen Magnetperlenrotation (AMBR), bei der magnetische Partikel mit einer anderen Geschwindigkeit rotieren als ein treibendes Magnetfeld . AMBR wurde zuvor in unserem Labor zur Messung der magnetischen Eigenschaften magnetischer Partikel [ 13 ], der dynamischen Viskosität , zum Nachweis von Bakterienzellen mit Einzelzellempfindlichkeit und zur Entwicklung eines tragbaren Sensors [ 14 ] verwendet. 
• Die asynchrone Rotation von Mikropartikeln wurde auch in einer Vielzahl anderer Systeme untersucht .Superparamagnetische Kügelchen, die hier mikrometergroße Kügelchen sind, die typischerweise jeweils aus einer inerten Polymerkugel bestehen, in die superparamagnetische Nanopartikel eingebettet sind, haben mehrere vorteilhafte Eigenschaften für die Verwendung als Markierungen.
•  Das magnetische Material der superparamagnetischen Kügelchen ist über die Zeit stabil, und die Kügelchen sind über eine Langzeitlagerung und unter den meisten physiologischen Bedingungen stabil. Biologische Proben enthalten normalerweise wenig oder gar kein natürlich vorkommendes magnetisches Material, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Hintergrundstörungen verringert wird (mit Ausnahme seltener Gegenbeispiele wie magnetotaktischer Bakterien [ 28 ]). Superparamagnetische Kügelchen werden leicht durch externe Magnetfelder manipuliert und können durch eine Vielzahl von Verfahren quantitativ nachgewiesen werden.

Sandwich-Immunassays sind übliche Assay-Techniken, die verwendet werden, um biologische Moleküle nachzuweisen. Ein Sandwich-Assay umfasst drei Komponenten: eine feste Phase, um den Analyten aus der Lösung zu isolieren; der Analyt selbst; und eine Markierung oder ein Indikator, der spezifisch an den Analyten bindet. Dadurch wird der Analyt zwischen Festphase und Markierung „eingeklemmt“ [ 29 ]. Einige der häufiger verwendeten Markierungen umfassen fluoreszierende Moleküle, Enzyme und superparamagnetische Kügelchen . Hier führen wir einen Sandwich-Assay auf der Oberfläche einer nichtmagnetischen Kugel mit superparamagnetischen Kügelchen als Markierungen durch.

Kügelchen, Partikel und magnetische Kügelchen im Mikrometermaßstab sind in einer Vielzahl von Größen im Handel erhältlich und mit Biotin oder Streptavidin beschichtet, was sie zu einem idealen Modellsystem für die Entwicklung neuer Immunoassays macht. Streptavidin ist ein tetrameres Protein (MW ~ 60 kDa), das aus den Bakterien Streptomyces avidinii isoliert wurde und eine sehr starke nichtkovalente Bindung ( K _d ≈ 10 ^–15 M) mit dem Protein Biotin (MW ~ 244) bildet [ 33 ]. Dieses Proteinpaar wurde zuvor verwendet, um Spin-Valve-Sensoren [ 34 ] und photonische Oberflächenkristallwellen [ 35 ] zu entwickeln]-Assays. In diesem Artikel dienen die Biotin-beschichteten Partikel als Nachahmung für einen biologischen Analyten. In zukünftigen Arbeiten werden Biotin und Streptavidin durch Proteine ​​und Antikörper von klinischem Interesse ersetzt.

Eine schematische Darstellung des Sensors ist in gezeigtAbb. 1. Der Aufbau besteht aus drei Komponenten: 6,7-μm-Streptavidin-beschichtete Festphasenkugeln, 40-nm-Biotin-beschichtete Partikel, die als Analytnachahmung dienen, und 1-μm-Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Markierungsperlen. Diese Abbildung demonstriert das Konzept der Markierungs-erworbenen Magnetorotation: Der Sandwich-Komplex dreht sich nur, wenn er magnetische Markierungen erworben hat, und dreht sich mit zusätzlichem Analyten schneller. Nach unserem besten Wissen stellt dieses Design die erste Kombination einer durch Markierung gewonnenen magnetischen Rotation mit einem Sandwich-Assay zum Nachweis eines biologischen Ziels dar.

Materialien und Methoden

1 × Dulbecco’s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde von MP Biomedicals (Solon, OH) bezogen. Tween-20 wurde von Acros Organics (Geel, Belgien) erhalten. 10% Rinderserumalbumin (BSA)-Blocker-Lösung wurde von Pierce (Rockford, IL) erhalten. 6,7 &mgr;m Streptavidin-beschichtete Polystyrol-Festphasenkugeln (Spherotech, Lake Forest, IL) mit einer Dichte von ρ = 1 g/cm ³ wurden dreimal durch Zentrifugieren gewaschen und der Überstand verworfen. Die Kugeln wurden dann resuspendiert und 1:10 in einer PBS-Lösung verdünnt, die 0,1 % Tween-20 und 0,1 % BSA (die als PBS-TB bezeichnet wird) enthielt, um die unspezifische Adsorption zu reduzieren, was zu einer Endkonzentration von 3,02 × 10 führte ³Kugeln/μl. 40 nm gelb-grün fluoreszierende Biotin-beschichtete Partikel (Invitrogen, Carlsbad, CA) wurden in PBS-TB auf Endkonzentrationen im Bereich von 1,62 × 10 ⁵ –5,12 × 10 ^{7 verdünnt}Partikel/μl. 10 &mgr;l der verdünnten 6,7 &mgr;m Streptavidin-beschichteten Festphasenkugeln wurden mit 10 &mgr;l jeder Biotin-beschichteten Partikellösung gemischt und Ende-über-Ende auf einem Rotationsmischer Sarmix SR1 (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) für 18 h inkubiert. Überschüssige biotinbeschichtete Teilchen wurden durch dreimaliges Zentrifugieren der Lösung und Verwerfen des Überstands entfernt, und die Probe wurde dann in PBS-TB resuspendiert. (Dieser Schritt war notwendig, da freie Biotin-beschichtete Partikel ein Verklumpen der Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Markierungskügelchen verursachen würden.) Erfolgreiches Binden und Waschen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie mit einer Lichtanregung von 488 nm bestätigt.

1 μm Dynal T1 Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Markierungsperlen (Invitrogen), ρ = 1,8 g/cm ³ , wurden dreimal gewaschen und dann resuspendiert und 50 × in PBS-TB verdünnt, für eine Endkonzentration von 1,94 × 10 ⁵Kügelchen/μl. Zwei Mikroliter der Biotin-beschichteten 6,7-μm-Kugeln und 2 μl der 1-μm-Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Markierungsperlen wurden gemischt und mit 26 μl PBS-TB verdünnt und dann in eine Vertiefung auf einer nicht bindenden Oberfläche mit 384 Vertiefungen überführt Platte (Corning, Corning, NY). Die Komponenten wurden 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation banden die 1-μm-Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Markierungsperlen an die exponierten Biotin-beschichteten Partikel auf den 6,7-μm-Streptavidin-beschichteten Festphasenkugeln und bildeten Kugel-Partikel-Kügelchen-Sandwichkomplexe. Eine fluidische Deckglaszelle wurde zwischen zwei 22 × 40 mm dicken Deckgläsern Nr. 0 (Pierce, Rockford, IL), die durch ein einzelnes Stück doppelseitiges durchsichtiges Klebeband (3M, St. Paul, MN) getrennt waren, hergestellt. Die Sandwich-Komplexe wurden von der 384-Well-Platte übertragen und in die Deckglas-Flüssigkeitszelle pipettiert.