Mit Streptavidin beschichtete Polystyrolpartikel

Dieser Beitrag stellt eine neuartige Anwendung magnetischer Partikel für die Biosensorik vor, die als Label-Acquired Magnetorotation (LAM) bezeichnet wird. Diese Methode basiert auf einer Kombination des traditionellen Sandwich-Assay-Formats mit der asynchronen Magnetic-Bead-Rotation (AMBR)-Methode. Bei der Markierungs-erworbenen Magnetorotation erleichtert ein Analyt die Bindung eines magnetischen Markierungskügelchens an eine nichtmagnetische Festphasenkugel, wodurch ein Sandwich-Komplex gebildet wird. Der Sandwich-Komplex wird dann in ein rotierendes Magnetfeld gebracht, wobei die Rotationsfrequenz des Sandwich-Komplexes eine Funktion der an der Oberfläche der Kugel anhaftenden Analytmenge ist. Hier verwenden wir Streptavidin-beschichtete Kügelchen und Biotin-beschichtete Partikel als Analytmimetika, die in zukünftigen Arbeiten durch Proteine ​​und andere biologische Ziele ersetzt werden sollen. Wir zeigen, dass dieses Erfassungsverfahren einen dynamischen Bereich von zwei Größenordnungen hat.

Einleitung

Magnetische Mikroperlen wurden in einer Vielzahl von Verfahren als Markierungen verwendet, um das Vorhandensein eines biologischen Moleküls anzuzeigen . Die Grundstruktur dieser Assays beinhaltet das Einfangen des Ziels von Interesse, entweder ein Antigen oder ein Antikörper, auf einer Oberfläche und die Verwendung von Antikörper-markierten magnetischen Kügelchen oder Partikeln, um an das Ziel zu binden. 

  • Das Vorhandensein der magnetischen Markierungen kann auf verschiedene Weise gemessen werden, einschließlich Änderungen des Magnetowiderstands , der Relaxationszeit , der Translationsbewegung  und der Partikelagglutination  In diesem Artikel demonstrieren wir die Label-erworbene Magnetorotation, bei der das Ziel die Bindung von magnetischen Label-Beads an eine nichtmagnetische Kugel erleichtert und die Rotationsfrequenz des resultierenden Sandwich-Komplexes in einem rotierenden Magnetfeld von der Anzahl der angebrachten magnetischen Label-Beads abhängt .
  • Die etikettenerworbene Magnetorotation basiert auf den Prinzipien der asynchronen Magnetperlenrotation (AMBR), bei der magnetische Partikel mit einer anderen Geschwindigkeit rotieren als ein treibendes Magnetfeld . AMBR wurde zuvor in unserem Labor zur Messung der magnetischen Eigenschaften magnetischer Partikel [ 13 ], der dynamischen Viskosität , zum Nachweis von Bakterienzellen mit Einzelzellempfindlichkeit und zur Entwicklung eines tragbaren Sensors [ 14 ] verwendet. 
  • Die asynchrone Rotation von Mikropartikeln wurde auch in einer Vielzahl anderer Systeme untersucht .Superparamagnetische Kügelchen, die hier mikrometergroße Kügelchen sind, die typischerweise jeweils aus einer inerten Polymerkugel bestehen, in die superparamagnetische Nanopartikel eingebettet sind, haben mehrere vorteilhafte Eigenschaften für die Verwendung als Markierungen.
  •  Das magnetische Material der superparamagnetischen Kügelchen ist über die Zeit stabil, und die Kügelchen sind über eine Langzeitlagerung und unter den meisten physiologischen Bedingungen stabil. Biologische Proben enthalten normalerweise wenig oder gar kein natürlich vorkommendes magnetisches Material, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Hintergrundstörungen verringert wird (mit Ausnahme seltener Gegenbeispiele wie magnetotaktischer Bakterien [ 28 ]). Superparamagnetische Kügelchen werden leicht durch externe Magnetfelder manipuliert und können durch eine Vielzahl von Verfahren quantitativ nachgewiesen werden.

Sandwich-Immunassays sind übliche Assay-Techniken, die verwendet werden, um biologische Moleküle nachzuweisen. Ein Sandwich-Assay umfasst drei Komponenten: eine feste Phase, um den Analyten aus der Lösung zu isolieren; der Analyt selbst; und eine Markierung oder ein Indikator, der spezifisch an den Analyten bindet. Dadurch wird der Analyt zwischen Festphase und Markierung „eingeklemmt“ [ 29 ]. Einige der häufiger verwendeten Markierungen umfassen fluoreszierende Moleküle, Enzyme und superparamagnetische Kügelchen . Hier führen wir einen Sandwich-Assay auf der Oberfläche einer nichtmagnetischen Kugel mit superparamagnetischen Kügelchen als Markierungen durch.

Kügelchen, Partikel und magnetische Kügelchen im Mikrometermaßstab sind in einer Vielzahl von Größen im Handel erhältlich und mit Biotin oder Streptavidin beschichtet, was sie zu einem idealen Modellsystem für die Entwicklung neuer Immunoassays macht. Streptavidin ist ein tetrameres Protein (MW ~ 60 kDa), das aus den Bakterien Streptomyces avidinii isoliert wurde und eine sehr starke nichtkovalente Bindung ( d ≈ 10 –15 M) mit dem Protein Biotin (MW ~ 244) bildet [ 33 ]. Dieses Proteinpaar wurde zuvor verwendet, um Spin-Valve-Sensoren [ 34 ] und photonische Oberflächenkristallwellen [ 35 ] zu entwickeln]-Assays. In diesem Artikel dienen die Biotin-beschichteten Partikel als Nachahmung für einen biologischen Analyten. In zukünftigen Arbeiten werden Biotin und Streptavidin durch Proteine ​​und Antikörper von klinischem Interesse ersetzt.

Eine schematische Darstellung des Sensors ist in gezeigtAbb. 1. Der Aufbau besteht aus drei Komponenten: 6,7-μm-Streptavidin-beschichtete Festphasenkugeln, 40-nm-Biotin-beschichtete Partikel, die als Analytnachahmung dienen, und 1-μm-Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Markierungsperlen. Diese Abbildung demonstriert das Konzept der Markierungs-erworbenen Magnetorotation: Der Sandwich-Komplex dreht sich nur, wenn er magnetische Markierungen erworben hat, und dreht sich mit zusätzlichem Analyten schneller. Nach unserem besten Wissen stellt dieses Design die erste Kombination einer durch Markierung gewonnenen magnetischen Rotation mit einem Sandwich-Assay zum Nachweis eines biologischen Ziels dar.

Materialien und Methoden

1 × Dulbecco’s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde von MP Biomedicals (Solon, OH) bezogen. Tween-20 wurde von Acros Organics (Geel, Belgien) erhalten. 10% Rinderserumalbumin (BSA)-Blocker-Lösung wurde von Pierce (Rockford, IL) erhalten. 6,7 &mgr;m Streptavidin-beschichtete Polystyrol-Festphasenkugeln (Spherotech, Lake Forest, IL) mit einer Dichte von ρ = 1 g/cm 3 wurden dreimal durch Zentrifugieren gewaschen und der Überstand verworfen. Die Kugeln wurden dann resuspendiert und 1:10 in einer PBS-Lösung verdünnt, die 0,1 % Tween-20 und 0,1 % BSA (die als PBS-TB bezeichnet wird) enthielt, um die unspezifische Adsorption zu reduzieren, was zu einer Endkonzentration von 3,02 × 10 führte 3Kugeln/μl. 40 nm gelb-grün fluoreszierende Biotin-beschichtete Partikel (Invitrogen, Carlsbad, CA) wurden in PBS-TB auf Endkonzentrationen im Bereich von 1,62 × 10 5 –5,12 × 10 7 verdünntPartikel/μl. 10 &mgr;l der verdünnten 6,7 &mgr;m Streptavidin-beschichteten Festphasenkugeln wurden mit 10 &mgr;l jeder Biotin-beschichteten Partikellösung gemischt und Ende-über-Ende auf einem Rotationsmischer Sarmix SR1 (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) für 18 h inkubiert. Überschüssige biotinbeschichtete Teilchen wurden durch dreimaliges Zentrifugieren der Lösung und Verwerfen des Überstands entfernt, und die Probe wurde dann in PBS-TB resuspendiert. (Dieser Schritt war notwendig, da freie Biotin-beschichtete Partikel ein Verklumpen der Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Markierungskügelchen verursachen würden.) Erfolgreiches Binden und Waschen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie mit einer Lichtanregung von 488 nm bestätigt.

Streptavidin Coated Polystyrene Particles

SVP-05-100 Spherotech 100 mL 1836 EUR

Streptavidin Coated Polystyrene Particles

SVP-2000-4 Spherotech 4 mL 466 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1 µm

DNM-M011 Creative Diagnostics 1 mL 636 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVBP-02-10 Spherotech 10 mL 263 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVBP-02-100 Spherotech 100 mL 1542 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVBP-03-10 Spherotech 10 mL 263 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVBP-03-100 Spherotech 100 mL 1542 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-03-10 Spherotech 10 mL 273 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-05-10 Spherotech 10 mL 273 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-08-10 Spherotech 10 mL 273 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-10-100 Spherotech 100 mL 3318 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-10-5 Spherotech 5 mL 283 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-100-4 Spherotech 4 mL 395 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-15-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-15-50 Spherotech 50 mL 1720 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-150-4 Spherotech 4 mL 411 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-20-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-200-4 Spherotech 4 mL 431 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-30-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-30-50 Spherotech 50 mL 1720 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-40-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-400-4 Spherotech 4 mL 492 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-50-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-60-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-60-50 Spherotech 50 mL 1720 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-800-05 Spherotech 5 mL 137 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP-800-4 Spherotech 4 mL 472 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP01-008-5 Spherotech 5 mL 426 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP1-200-4 Spherotech 4 mL 659 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP1-30-5 Spherotech 5 mL 482 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVP1-50-5 Spherotech 5 mL 482 EUR

Streptavidin Polystyrene Particles

SVPX-08-10 Spherotech 10 mL 273 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 0.3-0.4 µm

DNM-C005 Creative Diagnostics 10 mL 676 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 0.4-0.6 µm

DNM-C006 Creative Diagnostics 10 mL 823 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 0.7-0.9 µm

DNM-C007 Creative Diagnostics 10 mL 663 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm

DNM-C008 Creative Diagnostics 5 mL 823 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 3.0-3.9 µm

DNM-C009 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 4.0-4.9 µm

DNM-C010 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 5.0-5.9 µm

DNM-C011 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 6.0-8.0 µm

DNM-C012 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 8.0-12.9 µm

DNM-C013 Creative Diagnostics 4 mL 1000 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 13.0-17.9 µm

DNM-C014 Creative Diagnostics 4 mL 1079 EUR

DiagPoly Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 18.0-24.0 µm

DNM-C015 Creative Diagnostics 4 mL 1092 EUR

BSA Coated Polystyrene Particles

BP-08-10 Spherotech 10 mL 243 EUR

BSA Coated Polystyrene Particles

BP-30-5 Spherotech 5 mL 269 EUR

BSA Coated Polystyrene Particles

BP-60-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

BSA Coated Polystyrene Particles

BP2-150-5 Spherotech 5 mL 507 EUR

Anti-DNP Coated Polystyrene Particles

DNPP-50-2 Spherotech 2 mL 289 EUR

Ms IgG Coated Polystyrene Particles

MsGPX-50-5 Spherotech 5 mL 314 EUR

Anti-Digoxigenin Coated Polystyrene Particles

DIGP-05-2 Spherotech 2 mL 279 EUR

Anti-Digoxigenin Coated Polystyrene Particles

DIGP-20-2 Spherotech 2 mL 289 EUR

Anti-Digoxigenin Coated Polystyrene Particles

DIGP-40-2 Spherotech 2 mL 289 EUR

DiagPoly Streptavidin Polystyrene Particles, 25 µm

DNG-P078 Creative Diagnostics 1 mL 793 EUR

DiagPoly Streptavidin Polystyrene Particles, 30 µm

DNG-P079 Creative Diagnostics 1 mL 803 EUR

DiagPoly Streptavidin Polystyrene Particles, 40 µm

DNG-P080 Creative Diagnostics 1 mL 803 EUR

DiagPoly Streptavidin Polystyrene Particles, 50 µm

DNG-P081 Creative Diagnostics 1 mL 803 EUR

DiagPoly Streptavidin Polystyrene Particles, 100 µm

DNG-P082 Creative Diagnostics 1 mL 803 EUR

DiagPoly Streptavidin Polystyrene Particles, 12 µm

DNG-P225 Creative Diagnostics 1 mL 767 EUR

Ms Anti-FLAG M2 Coated Polystyrene Particles

MPAF-05-2 Spherotech 2 mL 310 EUR

Ms Anti-FLAG M2 Coated Polystyrene Particles

MPAF-20-2 Spherotech 2 mL 294 EUR

Streptavidin Polystyrene

SVP-1000-4 Spherotech 4 mL 472 EUR

DiagPoly Avidin Coated Polystyrene Particles, 0.7-0.9 µm

DNM-C001 Creative Diagnostics 10 mL 1010 EUR

DiagPoly Avidin Coated Polystyrene Particles, 1.0-1.4 µm

DNM-C002 Creative Diagnostics 10 mL 1010 EUR

DiagPoly Avidin Coated Polystyrene Particles, 3.0-3.9 µm

DNM-C003 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Avidin Coated Polystyrene Particles, 6.0-8.0 µm

DNM-C004 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Biotin Coated Polystyrene Particles, 0.7-0.9 µm

DNM-C016 Creative Diagnostics 10 mL 885 EUR

DiagPoly Biotin Coated Polystyrene Particles, 3.0-3.9 µm

DNM-C017 Creative Diagnostics 5 mL 885 EUR

DiagPoly Biotin Coated Polystyrene Particles, 6.0-8.6 µm

DNM-C018 Creative Diagnostics 5 mL 1000 EUR

Goat anti-Rat IgG (Fc) Coated Polystyrene Particles

RTPFC-60-5 Spherotech 5 mL 289 EUR

Polystyrene Particles

PP-008-10 Spherotech 10 mL 167 EUR

Polystyrene Particles

PP-008-100 Spherotech 100 mL 984 EUR

Polystyrene Particles

PP-015-10 Spherotech 10 mL 167 EUR

Polystyrene Particles

PP-025-10 Spherotech 10 mL 167 EUR

Polystyrene Particles

PP-025-100 Spherotech 100 mL 984 EUR

Polystyrene Particles

PP-05-10 Spherotech 10 mL 167 EUR

Polystyrene Particles

PP-05-100 Spherotech 100 mL 984 EUR

Polystyrene Particles

PP-08-10 Spherotech 10 mL 167 EUR

Polystyrene Particles

PP-08-100 Spherotech 100 mL 984 EUR

Polystyrene Particles

PP-10-10 Spherotech 10 mL 192 EUR

Polystyrene Particles

PP-10-100 Spherotech 100 mL 1187 EUR

Polystyrene Particles

PP-100-10 Spherotech 10 mL 239 EUR

Polystyrene Particles

PP-100-100 Spherotech 100 mL 1552 EUR

Polystyrene Particles

PP-15-10 Spherotech 10 mL 192 EUR

Polystyrene Particles

PP-150-10 Spherotech 10 mL 239 EUR

Polystyrene Particles

PP-20-10 Spherotech 10 mL 202 EUR

Polystyrene Particles

PP-20-100 Spherotech 100 mL 1268 EUR

Polystyrene Particles

PP-25-10 Spherotech 10 mL 208 EUR

Polystyrene Particles

PP-25-100 Spherotech 100 mL 1309 EUR

Polystyrene Particles

PP-30-10 Spherotech 10 mL 212 EUR

Polystyrene Particles

PP-30-100 Spherotech 100 mL 1349 EUR

Polystyrene Particles

PP-35-10 Spherotech 10 mL 212 EUR

Polystyrene Particles

PP-35-100 Spherotech 100 mL 1349 EUR

Polystyrene Particles

PP-40-10 Spherotech 10 mL 228 EUR

Polystyrene Particles

PP-40-100 Spherotech 100 mL 1471 EUR

Polystyrene Particles

PP-45-10 Spherotech 10 mL 228 EUR

Polystyrene Particles

PP-45-100 Spherotech 100 mL 1471 EUR

Polystyrene Particles

PP-50-10 Spherotech 10 mL 233 EUR

Polystyrene Particles

PP-50-100 Spherotech 100 mL 1512 EUR

Polystyrene Particles

PP-60-10 Spherotech 10 mL 259 EUR

Polystyrene Particles

PP-60-100 Spherotech 100 mL 1715 EUR

1 μm Dynal T1 Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Markierungsperlen (Invitrogen), ρ = 1,8 g/cm 3 , wurden dreimal gewaschen und dann resuspendiert und 50 × in PBS-TB verdünnt, für eine Endkonzentration von 1,94 × 10 5Kügelchen/μl. Zwei Mikroliter der Biotin-beschichteten 6,7-μm-Kugeln und 2 μl der 1-μm-Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Markierungsperlen wurden gemischt und mit 26 μl PBS-TB verdünnt und dann in eine Vertiefung auf einer nicht bindenden Oberfläche mit 384 Vertiefungen überführt Platte (Corning, Corning, NY). Die Komponenten wurden 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation banden die 1-μm-Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Markierungsperlen an die exponierten Biotin-beschichteten Partikel auf den 6,7-μm-Streptavidin-beschichteten Festphasenkugeln und bildeten Kugel-Partikel-Kügelchen-Sandwichkomplexe. Eine fluidische Deckglaszelle wurde zwischen zwei 22 × 40 mm dicken Deckgläsern Nr. 0 (Pierce, Rockford, IL), die durch ein einzelnes Stück doppelseitiges durchsichtiges Klebeband (3M, St. Paul, MN) getrennt waren, hergestellt. Die Sandwich-Komplexe wurden von der 384-Well-Platte übertragen und in die Deckglas-Flüssigkeitszelle pipettiert.

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